Inicio / Colaboradores / Ventana Molecular / Diagnóstico molecular del Coronavirus SARS-CoV-2. El método SHERLOCK

Diagnóstico molecular del Coronavirus SARS-CoV-2. El método SHERLOCK

Existe una necesidad inmediata de contar en los centros de atención de pacientes con COVID-19 de una herramienta diagnóstica para el SARS-CoV-2, cuyas características muestren una alta sensibilidad, específicidad, eficiente y económica. Actualmente, la prueba molecular considerada el estándar de oro en el diagnóstico del virus es la amplificación del gen N (proteína de la nucleocápsida) mediante una reacción cuantitativa de PCR en tiempo real (qRT-PCR, siglas en inglés); sin embargo, la disponibilidad limitada de reactivos y equipos y los largos tiempos de respuesta, han llevado a la búsqueda de métodos alternativos para el diagnóstico temprano y preciso del SARS-CoV-2.  Estos ensayos tienen soporte en el desarrollo de variantes de la plataforma de edición genética llamada CRISPR/Cas. La evaluación de algunos de estos nuevos métodos ha mostrado una especificidad y sensibilidad mayor o igual que la qRT-PCR, con un tiempo de detección muy inferior, uno de estos ensayos, DETECTR (SARS-CoV-2 DNA Endonuclease-Targeted Trans Reporter), fue discutido previamente. 1,2  

La primera aplicación del sistema CRISPR-Cas en el diagnóstico molecular del coronavirus SARS-CoV-2, fue la implementación  del método SHERLOCK (Specific High-sensitivityEnzymatic Reporter unLOCKing; en español: Desbloqueo de reportero de enzimas específicas de alta sensibilidad), basado en la sustitución en la plataforma CRISPR de la nucleasa Cas9 por la Cas 13a, cuya actividad es capaz de cortar RNA (una actividad de RNAsa) en lugar de DNA.3, 4 La secuencia blanco del ensayo se corresponde con el gen de la proteína S (proteína de pico), que interviene en el reconocimiento de células humanas, y el gen Orf1ab (codifica una replicasa de virus). Utilizando un kit comercial, estas secuencias  son sometidas a una reacción de amplificación  isotérmica  combinada de una recombinasa y polimerasa (LAMP-RPA); la presencia en la reacción de una transcriptasa inversa genera el DNA complementario (cDNA) correspondiente,  que será utilizado, en la misma reacción, para su transcripción in vitro produciendo el RNA viral blanco que será reconocido por los RNAs guías (gRNA) específicos produciendo la activación de la nucleasa Cas 13a. La enzima activada es capaz de cortar cualquier RNA presente en la reacción. La detección específica de la secuencia blanco del SARS-CoV-2, se lleva a cabo mediante métodos fluorescentes producto de la degradación de pequeños RNA reporteros incluidos en la reacción y portadores de un fluorosforo cuya emisión de fluorescencia está asociada a la actividad de la Cas 13a. De no estar presente la secuencia blanco diagnóstico específico, no es posible la activación de Cas 13a por lo tanto la reacción será negativa. El ensayo puede completarse en aproximadamente 1h, no necesita termociclador y muestra una sensibilidad del orden de 10-100 moléculas del coronavirus/microlitro.4 El ensayo ha sido validado utilizando muestras de personas negativas para el SARS-CoV-2, o que tenían una enfermedad respiratoria distinta de COVID-19. El diagnóstico aún no se ha probado en un centro clínico. Recientemente, la FDA otorgó autorización de emergencia, en mayo del presente año, para que una prueba basada en el sistema SHERLOCK sea utilizada en el diagnóstico de SARS-CoV-2.5

Comparativamente, como se muestra en la Tabla 1, tanto el ensayo SHERLOCK como DETECTR tienen varias ventajas respecto al ensayo de qRT-PCR para la detección de SARS-CoV-2, 2,6,7  entre ellas tenemos:

  1. sensibilidad comparable con la prueba estándar qRT-PCR
  2. menor tiempo del ensayo y obtención de resultados
  3. económicos, ya que no requieren de termociclador
  4. ambos métodos han sido validados en muestras clínicas; sin embargo, no se han implementado en centros clínicos

Otros métodos basados en CRISPR/Cas han sido descritos; sin embargo, en su mayoría no han sido validados con muestras clínicas.7

Alexis Mendoza-León, PhD. Email: [email protected]

Referencias

  1. CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel https://www.fda.gov/media/134922/download
  2. Broughton JP, Deng X, Yu G, Fasching CL  Servellita V, et al. CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 2020; 38: 870–874. DOI: 10.1038/s41587-020-0513-4.
  3. Kellner MJ, Koob JG, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Zhang F. 2019. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nature Protocols 14:2986-3012. https://doi.org/10.1038/s41596-019-0210-2
  4. Zhang, F., Abudayyeh, O. O. & Gootenberg, J. S. A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics. https://www.broadinstitute.org/files/publications/special/COVID-19%20detection%20(updated).pdf)
  5. Sherlock Biosciences Announces 2020.https://sherlock.bio/sherlock-biosciences-announces-clinical-data-from-dartmouth-hitchcock-health-pilot-study-of-sherlock-crispr-sars-cov-2-kit/).
  6. Montoliu L. 2020. CRISPR y coronavirus (https://montoliu.naukas.com/)    https://montoliu.naukas.com/2020/04/03/crispr-y-coronavirus/.
  7. Shravanti Surest. 2020. https://blog.addgene.org/sars-cov-2-covid-19-detection-methods-based-on-crispr-cas

 

 

 

 

Acerca de Alexis Mendoza-León

Alexis Mendoza-León, PhD. Venezolano, UCVista, Biólogo

6 comentarios

  1. Alexis Mendoza-León

    Recomiendo revisar el siguiente artículo publicado en el último No. de The New England Journal of Medicine:

    J. Joung and Others (2020). Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot Testing. The New England Journal of Medicine
    DOI: 10.1056/NEJMc2026172 | September 16, 2020
    https://www.nejm.org/doi/pdf/10.1056/NEJMc2026172?articleTools=true

  2. Alicia Ponte Sucre

    Gracias Alexis por este divulgativo ensayo sobre la metodologia Sherlock y Covid. Seguimos trabajando.
    Saludos,

  3. Buenos dias estimado amigo Alexis

    Estuve leyendo la nota que escribiste en Piel latinoamericana sobre Dx de coronavirus con los sistemas basados en Crispr/cas (SHERLOCK Y DETECTR). Estos sistemas a mi me parecen interesantes, pero me llama la atención que parece que no han sido usados extensivamente en el Dx de covid, por lo que uno ve en las publicaciones relacionadas con el tema. Y lo otro que quería comentarte es que aquí en Colombia los que usamos el protocolo de Berlín, y por el estado actual de pandemia, empleamos mas el gen E como gen inicial para el Dx y si tenemos una muestra dudosa, allí si le corremos el gen N o RdRp. Los primers para el gen RdRp del protocolo Berlin, hemos visto que no siempre amplifica en muestras que previamente habían amplificado los genes E y N. También usamos kits comerciales que detectan los tres genes en una sola reacción. Últimamente en Colombia esta tomando mucha fuerza el diagnostico basado en la prueba de detección de antígeno, por la facilidad y rapidez, pero se recomienda, para personas sintomáticas o que tuvieron un contacto estrecho con personas con covid19.

    • Alexis Mendoza-León

      Apropiado el comentario Carlos y de acuerdo contigo. Este método al igual que DETECTER son simples, sensibles y muy eficientes, como lo comparé en la tabla, porque no se han implementado en clínica no lo entiendo

  4. Alexis Mendoza-León

    Marisol: [email protected]
    Estimada Marisol, gracias por su comentario. La idea es tener conocimiento biológico de la pandemia

Deja una respuesta

Tu dirección de correo electrónico no será publicada. Los campos obligatorios están marcados con *

Este sitio web utiliza cookies para que usted tenga la mejor experiencia de usuario. Si continúa navegando está dando su consentimiento para la aceptación de las mencionadas cookies y la aceptación de nuestra política de cookies, pinche el enlace para mayor información.plugin cookies

ACEPTAR
Aviso de cookies