{"id":44924,"date":"2017-07-14T09:51:12","date_gmt":"2017-07-14T14:21:12","guid":{"rendered":"http:\/\/piel-l.org\/blog\/?p=44924"},"modified":"2017-07-14T22:11:37","modified_gmt":"2017-07-15T02:41:37","slug":"reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa-pcr-detalles-en-un-buen-ensayo","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/44924","title":{"rendered":"Reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa (PCR). Detalles en un buen ensayo"},"content":{"rendered":"

\"\"<\/a><\/p>\n

La reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction: PCR de sus siglas en ingl\u00e9s) no es m\u00e1s que un ensayo enzim\u00e1tico mediado por la acci\u00f3n de la enzima DNA polimerasa (DNApol), que permite la amplificaci\u00f3n in vitro<\/em>, en ciclos repetidos de reacci\u00f3n de secuencias espec\u00edficas de DNA (llamadas tambi\u00e9n templado o secuencia blanco). Los elementos involucrados en tal reacci\u00f3n son los siguientes: a.<\/strong> DNA, obtenido de cualquier organismo eucariota ej. levadura, hongo, humano, entre otros, o procariota ej. bacterias, virus; b.<\/strong> una secuencia de oligonucle\u00f3tidos iniciadores, llamados cebadores o primers<\/em>, definidos por la complementariedad en su secuencia de bases a una porci\u00f3n terminal de la secuencia de DNA blanco; c.<\/strong> deoxiribonucle\u00f3tidos trifosfato [dNTP: deoxiadenina trifosfato (dATP); deoxicitidina trifosfato (dCTP); deoxitimidina trifosfato (dTTP); y deoxiguanidina trifosfato (dGTP)], que son las unidades de construcci\u00f3n de la secuencia del DNA; y d.<\/strong> la enzima DNApol cuya temperatura \u00f3ptima es de 37 \u00b0C, o variantes como la Tag DNApol, aislada de la bacteria term\u00f3fila Thermophilus aquaticus<\/em>, con una temperatura \u00f3ptima sobre 70 \u00b0C.1,2<\/sup><\/strong><\/p>\n

El ensayo est\u00e1 basado en el proceso de replicaci\u00f3n o s\u00edntesis de DNA \u00a0de un organismo que ocurre durante la divisi\u00f3n celular, donde a trav\u00e9s de un proceso mediado por un complejo enzim\u00e1tico la doble h\u00e9lice del DNA nativo es abierta en un sitio particular llamado origen de replicaci\u00f3n generando parcialmente dos cadenas sencillas (fusi\u00f3n o denaturalizaci\u00f3n); dado que las cadenas que forman la doble h\u00e9lice del DNA son anti paralelas las mismas tienen diferente orientaci\u00f3n, una en sentido 5\u2019-3\u2019 y la otra en sentido 3\u2019-5\u2019, de acuerdo a la direccionalidad que une a los respectivos nucle\u00f3tidos (Ver figura).\u00a0\u00a0 Una enzima particular del complejo enzim\u00e1tico media la s\u00edntesis de un RNA iniciador (cebador o primer<\/em>) en sentido 5\u2019-3\u2019, que promueve a su vez el inicio de la s\u00edntesis de DNA por parte de la enzima DNApol sobre la cadena molde, en direcci\u00f3n 5\u2019-3\u2019, mediante la incorporaci\u00f3n de dNTP existentes en el medio de acuerdo al principio de complementariedad de bases. Una vez que se completa el proceso, el RNA iniciador es eliminado y reemplazado por DNA por acci\u00f3n enzim\u00e1tica.3<\/sup><\/strong> El proceso de replicaci\u00f3n por parte de la DNApol tiene un \u00f3ptimo de temperatura de 37 \u00b0C.<\/p>\n

In vitro<\/em>, el proceso de denaturalizaci\u00f3n del DNA total o de una secuencia particular de DNA puede llevarse a cabo bajo dos condiciones diferentes: a.<\/strong> incremento de pH mediante alcalinizaci\u00f3n de la soluci\u00f3n de DNA, por ej. utilizando hidr\u00f3xido de sodio, y b.<\/strong> incremento de temperatura mediante el \u00a0calentamiento de la soluci\u00f3n de DNA sobre 90 \u00b0C. Cualquiera de estas dos condiciones en un ensayo de amplificaci\u00f3n de DNA por PCR impide la utilizaci\u00f3n de la DNApol aislada de varios organismos, ya que el pH y temperatura \u00f3ptima de las mismas es de 7 y 37 \u00b0C respectivamente, de all\u00ed la importancia de contar con una enzima como la Taq-DNApol cuyo \u00f3ptimo de temperatura se encuentra sobre los 70 \u00b0C.<\/p>\n

La transici\u00f3n entre el estado nativo del DNA (doble h\u00e9lice) y su denaturalizaci\u00f3n ocurre en un rango de temperatura, permitiendo definir la temperatura de fusi\u00f3n del DNA o Tm como la tempera a la cual la mitad de la secuencia de DNA en estudio se encuentra en cadena sencilla y la otra mitad en su estado de doble cadena. El valor de Tm caracteriza una muestra de DNA y aunque depende de varios factores, el contenido de Guanina-Citocina (G-C) es determinante, mayor contenido de G-C en una secuencia de DNA mostrar\u00e1 mayor Tm en comparaci\u00f3n con una secuencia rica en Adenina-Timina (A-T).4<\/sup><\/strong><\/p>\n

En los ciclos de temperatura dise\u00f1ados en un ensayo de PCR, el Tm de los cebadores o primers<\/em> (Tmp) es de suma importancia, ya que la selecci\u00f3n de la temperatura de anillamiento o hibridaci\u00f3n de los cebadores depender\u00e1 de la longitud y composici\u00f3n de los mismos. Una consideraci\u00f3n importante es la selecci\u00f3n de un Tm igual o muy parecido entre los cebadores. La especificidad del ensayo esta en relaci\u00f3n directa con el rango de Tmp, mientras mayor es dicha temperatura (ej. 60 \u00b0C) mayor ser\u00e1 la especificidad de anillamiento de los cebadores.5<\/sup><\/strong><\/p>\n

La selecci\u00f3n adecuada de la temperatura de anillamiento de los oligonucle\u00f3tidos cebadores en un ensayo de PCR, es determinante en la especificidad\u00a0 y rendimiento del ensayo. De all\u00ed la recomendaci\u00f3n de no olvidar tomar las previsiones al respecto, ya que no siempre las temperaturas definidas en un kit o en la literatura son las m\u00e1s apropiadas para el ensayo particular que Ud. quiere llevar a cabo, la variabilidad gen\u00e9tica existe y el \u00e9xito de su ensayo puede estar relacionado con el dise\u00f1o de la secuencia de sus cebadores y la selecci\u00f3n de la temperatura de anillamiento en su ensayo.<\/p>\n

Referencias<\/em><\/strong><\/p>\n

    \n
  1. Zagal R. (2012, abril 15). PCR o Reacci\u00f3n en Cadena de la Polimerasa [YouTube]. Recuperado de\u00a0https:\/\/www.youtube.com\/watch?v=V9PtQlp-e7g<\/a><\/li>\n
  2. \u00a0CanalDivulgacion IQOG-CSIC. (2014, enero 2). PCR: Reacci\u00f3n en Cadena de la Polimerasa (IQOG-CSIC) [YouTube]. Recuperado de https:\/\/www.youtube.com\/watch?v=TalHTjA5gKU<\/a><\/li>\n
  3. Yourgenome.org [sede Web].Cambridge, UK: YG; 2017 [acceso 14 de julio 2017]. De YG.What is DNA replication? Disponible en: http:\/\/www.yourgenome.org\/facts\/what-is-dna-replication<\/a><\/li>\n
  4. Propanona.blogspot.com [sede Web]. Mountain View: Blogger; 2017 [acceso 14 de julio 2017]. De Blogger. Desnaturalizaci\u00f3n o fusi\u00f3n del ADN. Disponible en: \u00a0http:\/\/propanona.blogspot.com\/2014\/08\/desnaturalizacion-o-fusion-del-adn.html<\/a><\/li>\n
  5. Pinz\u00f3n AM, editor. Introducci\u00f3n al dise\u00f1o \u201cin silico\u201d de primers. [Internet]. Bogot\u00e1: Laboratorio de Micolog\u00eda y Fitopatolog\u00eda de la Universidad de los Andes; 2007 [citado 14 julio 2017].Disponible en: http:\/\/bioinf.ibun.unal.edu.co\/cbib\/estudiantes\/1-07\/primerDesign.pdf<\/a><\/li>\n<\/ol>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

    La reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction: PCR de sus siglas en ingl\u00e9s) no es m\u00e1s que un ensayo enzim\u00e1tico mediado por la acci\u00f3n de la enzima DNA polimerasa (DNApol), que permite la amplificaci\u00f3n in vitro, en ciclos repetidos de reacci\u00f3n de secuencias espec\u00edficas de DNA (llamadas tambi\u00e9n templado o secuencia blanco).<\/p>\n","protected":false},"author":57,"featured_media":44925,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[446],"tags":[],"class_list":["post-44924","post","type-post","status-publish","format-standard","has-post-thumbnail","","category-ventana-molecular"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/44924","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/users\/57"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=44924"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/44924\/revisions"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/media\/44925"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=44924"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=44924"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=44924"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}