{"id":48279,"date":"2020-06-05T12:50:58","date_gmt":"2020-06-05T17:20:58","guid":{"rendered":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/?p=48279"},"modified":"2020-06-06T16:49:11","modified_gmt":"2020-06-06T21:19:11","slug":"crispr-vs-la-deteccion-molecular-del-coronavirus-sars-cov-2","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/48279","title":{"rendered":"CRISPR vs. La detecci\u00f3n molecular del Coronavirus SARS-CoV-2"},"content":{"rendered":"

\"\"<\/a><\/p>\n

El coronavirus SARS-CoV-2 produce en humanos\u00a0 la enfermedad conocida como COVID-19, es un virus RNA de cadena sencilla, que accede a c\u00e9lulas de nuestro organismo<\/strong> a trav\u00e9s de la interacci\u00f3n de la prote\u00edna de espiga S<\/strong> (S: spike protein) presente en la superficie del virus, con un receptor celular humano ACE2<\/strong> (angiotensin-converting enzyme-2: ACE2, siglas en ingl\u00e9s) presente en la superficie de c\u00e9lulas de la mucosa, pulmones, etc., una vez dentro de la c\u00e9lula del hospedador, se inicia la replicaci\u00f3n del material gen\u00e9tico del virus (RNA) y la producci\u00f3n de nuevas part\u00edculas virales. La\u00a0 \u00a0propagaci\u00f3n de la enfermedad ha sido tan r\u00e1pida a nivel mundial que\u00a0se ha convertido en un problema de salud p\u00fablica, lo cual ha tra\u00eddo como consecuencia que la Organizaci\u00f3n Mundial de la Salud (OMS) haya declarado la enfermedad como una pandemia mundial global, lo cual a su vez ha generado la necesidad inmediata de desarrollar m\u00e9todos de detecci\u00f3n del virus de gran precisi\u00f3n, r\u00e1pidos y rentable. Impresionante ha sido el impacto cient\u00edfico que ha tenido el estudio de este nuevo virus, generando una gran cantidad de informaci\u00f3n a trav\u00e9s de publicaciones cient\u00edficas y ciencia abierta.1<\/sup><\/strong><\/p>\n

La identificaci\u00f3n del SARS-CoV-2 en pacientes que presentan la enfermedad, puede llevarse a cabo a trav\u00e9s de t\u00e9cnicas moleculares asociadas a su material gen\u00e9tico, o mediante aproximaciones inmunol\u00f3gicas.<\/strong> La prueba molecular que se ha utilizado con mayor sensibilidad y confiabilidad, y considerada como la prueba de oro, es una variante de la reacci\u00f3n de PCR est\u00e1ndar llamada\u00a0 PCR en tiempo real (Real-Time PCR: RT-PCR, siglas en ingl\u00e9s) que incluye la enzima transcriptasa inversa cuya funci\u00f3n es llevar a cabo la s\u00edntesis de DNA a partir del material gen\u00e9tico viral (RNA). Las muestras utilizadas para llevar a cabo dicha prueba provienen de secreciones respiratorias como exudados nasofar\u00edngeos u otras muestras del tracto respiratorio superior, incluyendo hisopados de garganta, esputo y saliva.2<\/sup><\/strong><\/p>\n

Varios son los blancos gen\u00e9ticos del virus que pueden amplificarse de forma espec\u00edfica, por ej. \u00a0secuencias del genoma viral que generan la prote\u00edna de espiga (S), marco abierto de lectura 1ab (open reading frame: ORF1ab. <\/em>Siglas en ingl\u00e9s), o la nucleoc\u00e1psida N, entre otros. Este \u00faltimo es utilizado para la prueba CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel.3,4,5<\/sup><\/strong><\/p>\n

Aunque la RT-PCR es una t\u00e9cnica de alta sensibilidad y especificidad, algunas limitaciones han sido indicadas, entre ellas se incluyen las siguientes: a.<\/strong> se requiere de equipo y personal especializado para llevarla a cabo; b.<\/strong>\u00a0 requiere al menos 3-4 horas para obtener resultados; y c.<\/strong> la toma y manipulaci\u00f3n de la muestra a analizar es importante, dado que un mal manejo de la misma puede generar falsos positivos al igual que falsos negativos. Debido a lo anterior, la b\u00fasqueda de nuevos m\u00e9todos alternativos para el diagn\u00f3stico temprano y preciso del SARS-CoV-2<\/strong> es una necesidad. Algunos de estos nuevos m\u00e9todos est\u00e1n combinados con la t\u00e9cnica de edici\u00f3n gen\u00e9tica llamada CRISPR.<\/p>\n

Uno de estos nuevos ensayos, llamado SARS-CoV-2 DNA Endonuclease-Targeted Trans Reporter CRISPR (DETECTR), est\u00e1 basado en la t\u00e9cnica de edici\u00f3n gen\u00e9tica CRISPR-Cas129-13 para la detecci\u00f3n de SARS-CoV-2, a partir de RNA de muestras extra\u00eddas de paciente. En dicho ensayo, los autores llevan a cabo en forma simult\u00e1nea la transcripci\u00f3n inversa del RNA y la amplificaci\u00f3n de la hebra de DNA obtenida, mediante una reacci\u00f3n de PCR isot\u00e9rmica (RT-LAMP: Loop-Mediated Isothermal Amplification Method).6,7<\/sup><\/strong><\/p>\n

Los cebadores de la reacci\u00f3n de amplificaci\u00f3n LAMP fueron dise\u00f1ados, y modificados para la amplificaci\u00f3n de los genes E (envoltura) y N (nucleoprote\u00edna) del SARS-CoV-2, de manera similar a aquellos utilizados por el ensayo RT-PCR de la OMS y del CDC de EE. UU. El siguiente paso fue el dise\u00f1o de los RNA gu\u00edas (gRNA) para direccionar la acci\u00f3n de la nucleasa Cas12 y detectar en forma diferencial los coronavirus de tipo SARS: a.<\/strong> SARS-CoV-2 (acceso NC_045512); b.<\/strong> coronavirus de tipo SARS murci\u00e9lago (bat-SL-CoVZC45, acceso MG772933); y c.<\/strong> SARSCoV (acceso NC_004718), en el gen E y espec\u00edficamente detectar solo SARS-CoV-2 en el gen N. Los resultados mostraron que la detecci\u00f3n basada en CRISPR-Cas12 puede distinguir SARS-CoV-2 sin reactividad cruzada para las cepas de coronavirus relacionadas utilizando gRNA del gen N y con reactividad cruzada esperada para el gRNA del gen E. El ensayo DETECTR puede ejecutarse en aproximadamente 30-40 min y el resultado puede visualizarse en una tira de flujo lateral a trav\u00e9s de un marcador reportero como biotina luego de amplificaci\u00f3n y acci\u00f3n del sistema Cas12-gRNA.6<\/sup><\/strong><\/p>\n

Cuando se compar\u00f3 el l\u00edmite anal\u00edtico de detecci\u00f3n (LoD) del ensayo fluorescente RT-LAMP \/ Cas12 DETECTR en relaci\u00f3n con el ensayo de RT-PCR-CDC aprobado por el Departamento de Salud P\u00fablica, EUA. para la detecci\u00f3n de SARS-CoV-2, se muestra que la LoD estimad para este \u00faltimo es de 1 copia por microlitros de reacci\u00f3n, lo que es consistente con el rendimiento anal\u00edtico en el prospecto de la FDA de EE. UU., frente a 10 copias por microlitros de reacci\u00f3n para el ensayo DETECTR. Por otro lado, el ensayo DETECTR ofrece una alternativa visual m\u00e1s r\u00e1pida respecto al ensayo de RT-PCR para SARS-CoV-2 de los Centros para el Control y la Prevenci\u00f3n de Enfermedades de EE. UU., con una lectura cualitativa de f\u00e1cil interpretaci\u00f3n, con una predicci\u00f3n positiva del 95% luego de un estudio comparativo de 83 muestras del tracto respiratorio de pacientes afectados de la enfermedad.<\/p>\n

La combinaci\u00f3n de la amplificaci\u00f3n isot\u00e9rmica con la tecnolog\u00eda CRISPR-Cas12 en el ensayo DETECTR, mostr\u00f3 una serie de ventajas importantes, entre las cuales tenemos: a.<\/strong> se desarrolla una prueba r\u00e1pida\u00a0 para la detecci\u00f3n de SARS-CoV-2 en muestras cl\u00ednicas (30-40 min), con una precisi\u00f3n comparable a la qRT-PCR; b.<\/strong> no existe la necesidad de un equipo de PCR (termociclador); y c.<\/strong> tal como lo indican los autores, el ensayo podr\u00eda permitir pruebas en puntos de atenci\u00f3n fuera del laboratorio de diagn\u00f3stico cl\u00ednico, como aeropuertos, departamentos de emergencia locales y cl\u00ednicas y otros lugares.<\/p>\n

Dicho ensayo ha sido validado en muestras de referencia artificiales y muestras cl\u00ednicas de pacientes en los Estados Unidos. La validaci\u00f3n cl\u00ednica de este ensayo en respuesta al reciente borrador de orientaci\u00f3n de la FDA de EE.UU., est\u00e1 en curso.<\/p>\n

Referencias <\/strong><\/p>\n

\u00a0<\/strong><\/p>\n

    \n
  1. Galocha A. & Dom\u00ednguez N. (2020). As\u00ed infecta el Coronavirus. https:\/\/elpais.com\/elpais\/2020\/03\/06\/ciencia\/1583515780_532983.html<\/a><\/li>\n
  2. Intra Med (2020) Interpretaci\u00f3n de pruebas diagn\u00f3sticas. doi:10.1128\/JCM.00557-20. 2.\u00a0 https:\/\/www.intramed.net\/contenidover.asp?contenidoid=96110&pagina=1<\/a><\/li>\n
  3. Rub\u00e9n Meg\u00eda Gonz\u00e1lez 2020<\/strong> https:\/\/genotipia.com\/sars-cov-2-pcr\/<\/a>.<\/li>\n
  4. CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel https:\/\/www.fda.gov\/media\/134922\/download<\/a><\/li>\n
  5. SINC (2020). As\u00ed son las pruebas de PCR que se utilizan para detector el coronavirus. https:\/\/www.agenciasinc.es\/Noticias\/Asi-son-las-pruebas-PCR-que-se-utilizan-para-detectar-el-coronavirus<\/a><\/li>\n
  6. Broughton, J.P.et al.\u00a0(2020).\u00a0 Nat Biotechnol<\/em>\u00a0https:\/\/doi.org\/10.1038\/s41587-020-0513-4<\/a>. https:\/\/www.nature.com\/articles\/s41587-020-0513-4<\/a><\/li>\n
  7. Mendoza-Le\u00f3n A. (2010). Diagn\u00f3stico Molecular de Enfermedades Infecciosas: Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Method. https:\/\/piel-l.org\/blog\/18238<\/a><\/li>\n<\/ol>\n

    Imagen tomada de As\u00ed infecta el coronavirus, El Pa\u00eds Espa\u00f1a https:\/\/elpais.com\/elpais\/2020\/03\/06\/ciencia\/1583515780_532983.html?ssm=TW_CC a trav\u00e9s de @materia_ciencia <\/em><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

    La combinaci\u00f3n de la amplificaci\u00f3n isot\u00e9rmica con la tecnolog\u00eda CRISPR-Cas12 en el ensayo DETECTR, mostr\u00f3 una serie de ventajas importantes<\/p>\n","protected":false},"author":57,"featured_media":48280,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[446],"tags":[],"class_list":["post-48279","post","type-post","status-publish","format-standard","has-post-thumbnail","","category-ventana-molecular"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/48279","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/users\/57"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=48279"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/48279\/revisions"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/media\/48280"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=48279"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=48279"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=48279"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}