{"id":48452,"date":"2020-09-11T07:29:24","date_gmt":"2020-09-11T11:59:24","guid":{"rendered":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/?p=48452"},"modified":"2020-09-12T16:55:43","modified_gmt":"2020-09-12T21:25:43","slug":"diagnostico-molecular-del-coronavirus-sars-cov-2","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/piel-l.org\/blog\/48452","title":{"rendered":"Diagn\u00f3stico molecular del Coronavirus SARS-CoV-2. El m\u00e9todo SHERLOCK"},"content":{"rendered":"

\"\"<\/a><\/p>\n

Existe una necesidad inmediata de contar en los centros de atenci\u00f3n de pacientes con COVID-19 de una herramienta diagn\u00f3stica para el SARS-CoV-2, cuyas caracter\u00edsticas muestren una alta sensibilidad, espec\u00edficidad, eficiente y econ\u00f3mica. Actualmente, la prueba molecular considerada el est\u00e1ndar de oro en el diagn\u00f3stico del virus es la amplificaci\u00f3n del gen N (prote\u00edna de la nucleoc\u00e1psida) mediante una reacci\u00f3n cuantitativa de PCR en tiempo real (qRT-PCR, siglas en ingl\u00e9s); sin embargo, la disponibilidad limitada de reactivos y equipos y los largos tiempos de respuesta, han llevado a la b\u00fasqueda de m\u00e9todos alternativos para el diagn\u00f3stico temprano y preciso del\u00a0SARS-CoV-2<\/strong>. <\/strong>\u00a0<\/sup><\/strong>Estos ensayos tienen soporte en el desarrollo de variantes de la plataforma de edici\u00f3n gen\u00e9tica llamada CRISPR\/Cas. La evaluaci\u00f3n de algunos de estos nuevos m\u00e9todos ha mostrado una especificidad y sensibilidad mayor o igual que la qRT-PCR, con un tiempo de detecci\u00f3n muy inferior, uno de estos ensayos, DETECTR (SARS-CoV-2 DNA Endonuclease-Targeted Trans Reporter), fue discutido previamente. 1,<\/sup><\/strong>2<\/sup> \u00a0<\/strong><\/p>\n

La primera aplicaci\u00f3n del sistema CRISPR-Cas en el diagn\u00f3stico molecular del coronavirus SARS-CoV-2, fue la implementaci\u00f3n\u00a0 del m\u00e9todo SHERLOCK (Specific High-sensitivityEnzymatic Reporter unLOCKing; en espa\u00f1ol: Desbloqueo de reportero de enzimas espec\u00edficas de alta sensibilidad), basado en la sustituci\u00f3n en la plataforma CRISPR de la nucleasa Cas9 por la Cas 13a, cuya actividad es capaz de cortar RNA (una actividad de RNAsa) en lugar de DNA.3, 4<\/sup><\/strong> La secuencia blanco del ensayo se corresponde con el gen de la prote\u00edna S (prote\u00edna de pico), que interviene en el reconocimiento de c\u00e9lulas humanas, y el gen Orf1ab (codifica una replicasa de virus). Utilizando un kit comercial, estas secuencias \u00a0son sometidas a una reacci\u00f3n de amplificaci\u00f3n \u00a0isot\u00e9rmica \u00a0combinada de una recombinasa y polimerasa (LAMP-RPA); la presencia en la reacci\u00f3n de una transcriptasa inversa genera el DNA complementario (cDNA) correspondiente, \u00a0que ser\u00e1 utilizado, en la misma reacci\u00f3n, para su transcripci\u00f3n in vitro<\/em> produciendo el RNA viral blanco que ser\u00e1 reconocido por los RNAs gu\u00edas (gRNA) espec\u00edficos produciendo la activaci\u00f3n de la nucleasa Cas 13a. La enzima activada es capaz de cortar cualquier RNA presente en la reacci\u00f3n. La detecci\u00f3n espec\u00edfica de la secuencia blanco del SARS-CoV-2, se lleva a cabo mediante m\u00e9todos fluorescentes producto de la degradaci\u00f3n de peque\u00f1os RNA reporteros incluidos en la reacci\u00f3n y portadores de un fluorosforo cuya emisi\u00f3n de fluorescencia est\u00e1 asociada a la actividad de la Cas 13a. De no estar presente la secuencia blanco diagn\u00f3stico espec\u00edfico, no es posible la activaci\u00f3n de Cas 13a por lo tanto la reacci\u00f3n ser\u00e1 negativa. El ensayo puede completarse en aproximadamente 1h, no necesita termociclador y muestra una sensibilidad del orden de 10-100 mol\u00e9culas del coronavirus\/microlitro.4 <\/sup><\/strong>El ensayo ha sido validado utilizando muestras de personas negativas para el SARS-CoV-2, o que ten\u00edan una enfermedad respiratoria distinta de COVID-19. El diagn\u00f3stico a\u00fan no se ha probado en un centro cl\u00ednico. Recientemente, la FDA otorg\u00f3 autorizaci\u00f3n de emergencia, en mayo del presente a\u00f1o, para que una prueba basada en el sistema SHERLOCK sea utilizada en el diagn\u00f3stico de SARS-CoV-2.5<\/sup><\/strong><\/p>\n

\"\"<\/a><\/p>\n

Comparativamente, como se muestra en la Tabla 1, tanto el ensayo SHERLOCK como DETECTR tienen varias ventajas respecto al ensayo de qRT-PCR para la detecci\u00f3n de SARS-CoV-2, 2,6<\/sup><\/strong>,<\/sup><\/strong>7 <\/sup><\/strong>\u00a0entre ellas tenemos:<\/p>\n

    \n
  1. sensibilidad comparable con la prueba est\u00e1ndar qRT-PCR<\/li>\n
  2. menor tiempo del ensayo y obtenci\u00f3n de resultados<\/li>\n
  3. econ\u00f3micos, ya que no requieren de termociclador<\/li>\n
  4. ambos m\u00e9todos han sido validados en muestras cl\u00ednicas; sin embargo, no se han implementado en centros cl\u00ednicos<\/li>\n<\/ol>\n

    Otros m\u00e9todos basados en CRISPR\/Cas han sido descritos; sin embargo, en su mayor\u00eda no han sido validados con muestras cl\u00ednicas.7<\/sup><\/strong><\/p>\n

    Alexis Mendoza-Le\u00f3n, PhD. <\/strong>Email: <\/strong>amendoza50@gmail.com<\/strong><\/a><\/p>\n

    Referencias<\/strong><\/p>\n

      \n
    1. CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel https:\/\/www.fda.gov\/media\/134922\/download<\/a><\/li>\n
    2. Broughton JP, Deng X, Yu G,\u00a0Fasching<\/a> CL\u00a0<\/sup>,\u00a0 Servellita<\/a> V, et al.<\/em>\u00a0CRISPR\u2013Cas12-based detection of SARS-CoV-2.\u00a0Nat Biotechnol.\u00a02020; 38:\u00a0870\u2013874.\u00a0DOI: 10.1038\/s41587-020-0513-4<\/a>.<\/li>\n
    3. Kellner MJ, Koob JG, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Zhang F. 2019. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nature Protocols 14:2986-3012. https:\/\/doi.org\/10.1038\/s41596-019-0210-2<\/li>\n
    4. Zhang, F., Abudayyeh, O. O. & Gootenberg, J. S. A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics. https:\/\/www.broadinstitute.org\/files\/publications\/special\/COVID-19%20detection%20(updated).pdf)<\/a><\/li>\n
    5. Sherlock Biosciences Announces\u00a02020.https:\/\/sherlock.bio\/sherlock-biosciences-announces-clinical-data-from-dartmouth-hitchcock-health-pilot-study-of-sherlock-crispr-sars-cov-2-kit\/).<\/li>\n
    6. Montoliu L. 2020. CRISPR y coronavirus (https:\/\/montoliu.naukas.com\/)\u00a0\u00a0\u00a0 https:\/\/montoliu.naukas.com\/2020\/04\/03\/crispr-y-coronavirus\/<\/a>.<\/li>\n
    7. Shravanti Surest. 2020. https:\/\/blog.addgene.org\/sars-cov-2-covid-19-detection-methods-based-on-crispr-cas<\/a><\/li>\n<\/ol>\n

      \u00a0<\/strong><\/p>\n

       <\/p>\n

       <\/p>\n

      \u00a0<\/strong><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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