CAPITULO 85: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otras técnicas moleculares en el estudio de afecciones dermatológicas

Reacción en Cadena de la Polimerasa

La Reacción en Cadena de la Polimerasa, conocida como P.C.R por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis que permite la síntesis “in Vitro” de secuencias específicas de ácido desoxirribonucleico (ADN) 1 .

Fundamentos e Importancia

La técnica se basa en la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada por la ADN polimerasa. Esta enzima realiza la síntesis de una cadena complementaria de ADN en sentido 5`• 3`usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear esta región de doble cadena, se utilizan los denominados iniciadores (primers ). Estos son una pareja de oligonucleótidos diseñados de tal manera que sean complementarios a cada uno de los extremos del fragmento de ADN que se quiere amplificar.

Este proceso se lleva a cabo mediante ciclos alternados de temperaturas altas y bajas, que permiten separar las hebras de ADN formadas entre si tras cada fase de replicación y, la unión nuevamente de estas hebras con la polimerasa para que vuelvan a duplicarse.

Todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, el cual permite calentar y enfriar los tubos de reacción (efecto Peltier) controlando la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. La automatización del proceso se debe al descubrimiento de la enzima Taq polimerasa termoestable, extraida del Thermus aquaticus2, que eliminó el inconveniente de agregar enzima fresca en cada paso de la reacción.

Fig 1.-Equipo (maquina de PCR), utilizado para la amplificación del ADN. La maquina se programa con las temperaturas necesarias para cada paso de la reacción y todo el proceso de amplificación se realiza automáticamente.

En la actualidad, la PCR es una técnica de rutina indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica con una gran variedad de aplicaciones.

La clonación del ADN para la secuenciación, la filogenia basada en el ADN, el análisis funcional de genes, el diagnostico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y prueba de paternidad), taxonomía, la detección y diagnostico de enfermedades infecciosas, son algunas de las aplicaciones donde la PCR ha sido implementada como una técnica de gran valor.

Componentes de la PCR

Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs). Es una mezcla de deoxi nucleótidos que sirve de sustrato para la síntesis de nuevo ADN.

Iniciadores (primers). Dos oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre 10-30 nucleótidos, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reacción. Deben estar enfrentados (uno en cada hebra del ADN), para delimitar el fragmento a amplificar).

ADN polimerasa. El descubrimiento en 1976 de la Taq polimerasa, una ADN polimerasa extraída de la bacteria termófila Thermus aquaticus que habita medios de muy alta temperatura (50-80 °C), eliminó los grandes inconvenientes del método de la PCR. Esta ADN polimerasa es estable a altas temperaturas, permaneciendo activa hasta después de la desnaturalización del ADN

ADN molde. Molécula que contiene la región de ADN que se va a amplificar.

Etapas de la PCR

La PCR consiste en una serie de cambios repetidos de temperatura llamados ciclos. Por lo general el número de ciclos es de 20 a 30, cada ciclo consiste en tres cambios de temperatura. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo, dependen de algunos parámetros en los que se incluye, la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y dNTPs en la reacción así como la temperatura de unión de los iniciadores

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Desnaturalización del ADN

En la primera etapa, la reacción es llevada a una temperatura de 94-96ºC y se mantiene entre 30 segundos y un minuto. A estas temperaturas el ADN se desnaturaliza (se separan las dos hebras que lo constituyen). La temperatura a la cual se decide llevar a cabo esta etapa va a depender de la proporción de Guanina-Citocina (G-C) que tenga la hebra, así como también del largo de la misma.

Alineamiento/Unión del iniciador a la secuencia complementaria

En la segunda etapa también conocida como hibridación, los iniciadores se unen a las regiones 3`complementarias que flanquean el fragmento que se quiere amplificar. Para ello, es necesario bajar la temperatura a 50-65ºC durante 20-40 segundos, permitiendo así el alineamiento. La polimerasa se une entonces al hibrido formado por la cadena molde y el iniciador y empieza la síntesis del ADN. Los iniciadores actúan como límite de la región de la molécula que va a ser amplificada.

Extensión/Elongación de la cadena

En la tercera etapa, la polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementario a la hebra molde, añadiendo los dNTPs complementarios en dirección 5`• 3` uniendo el grupo 5`-fosfato de los dNTPs con el grupo 3`-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente. La temperatura en esta etapa depende de la ADN polimerasa que se utilice. Para la Taq polimerasa, la temperatura de máxima actividad está entre 74-80ºC, aunque por lo general se usa 74ºC. El tiempo de elongación va a depender del tipo de polimerasa empleado, así como también del tamaño del fragmento de ADN que se requiere amplificar.

Elongación final

En la cuarta etapa, la temperatura es regulada de 70-74ºC durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR, con el objeto de asegurar que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente amplificado.

Por último, el producto amplificado es mantenido a una temperatura de 4ºC por un periodo indefinido lo cual permite conservar el producto de la reacción

Para comprobar que la PCR ha generado el fragmento de ADN esperado, se emplean técnicas como la electroforesis, que permite separar los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su tamaño. Por lo general se emplea la electroforesis en gel de agarosa para fragmentos grandes, en acrilamida para fragmentos más pequeños y asociada a marcaje fluorescente así como la electroforesis capilar3, 4

Fig 2.-Equipo de electroforesis utilizado para la separación de los productos amplificados por la PCR.

La detección del producto de la Reacción en Cadena de la Polimerasa se realiza normalmente mediante una corrida electroforética. Dependiendo del tamaño del producto de la amplificación y la resolución que se desea, se utilizan diferentes matrices de separación (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones. La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio con una lámpara de luz UV, tinción de plata, fluorescencia o radioactividad.

De igual forma, la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridación (unión complementaria) con una sonda marcada radiactivamente, cuya secuencia de bases esté contenida en el fragmento de interés.

Los tamaños de los productos de PCR se determinan comparando los mismos, con marcadores que contienen fragmentos de ADN de tamaño conocido los cuales se corren en el gel junto a los productos de PCR.

La Fig 3 muestra en la línea M, los marcadores de ADN, el tamaño de cada fragmento esta expresado en kilo pares de bases (Kbp) asignados en números al lado izquierdo de la figura.

.Esquema general de la PCR.

Fig 4:_ Representa de manera esquemática el proceso de amplificación a partir del ADN extraído de la muestra. En cada ciclo se duplica el número de copias del ADN que se amplifica

Contaminación en la PCR

La reacción en cadena de la polimerasa PCR es una técnica altamente sensible y especifica, por lo que es muy importante evitar contaminaciones que puedan dar origen a la amplificación de ADN no deseado.

La contaminación con ADN extraño puede solucionarse con protocolos y procedimientos que separen las reacciones pre-PCR (mezcla de todos los componentes de la reacción), del ADN molde. Esto normalmente implica la separación espacial de las áreas de realización de la PCR de los de análisis o purificación de los productos, así como la limpieza exhaustiva de la superficie de trabajo entre la realización de un PCR y el siguiente.

Tipos de PCR

PCR anidada

En esta variante de PCR, el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con iniciadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es altamente específica 5

PCR in situ

Es una PCR que se realiza en preparaciones fijadas sobre un portaobjeto. Consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Se realiza para ello una primera amplificación del ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera puede detectarse cantidades pequeñísimas del material genético 6

PCR multiplex

Es una PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea dos o más pares de iniciadores en un único tubo de reacción con el fin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una única reacción todos los pares de iniciadores de los sistemas que queremos amplificar simultáneamente, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes. La ventaja de esta PCR es que se obtiene la información de varios loci en una sola reacción, utilizando menor cantidad de molde para el análisis y menor cantidad de reactivos. Se puede generar rápidamente la construcción de una base de datos 7 .

RT-PCR

Este tipo de PCR utiliza como molde inicial el ARN y se requiere de una transcriptasa inversa, para realizar la conversión del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc (ADN complementario) 8 .

PCR tiempo real

Es una reacción de PRC cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra original 9. Se puede dividir en:

a-Técnica basada en fluorocromos no específicos.

b-Técnica basada en sondas específicas.

En las técnicas basadas en fluorocromos no específicos, el ADN se une al fluorocromo (por lo general SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por un termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar sólo una secuencia por reacción, pero tiene la ventaja de utilizar iniciadores normales para su realización. Es mucho más económica que la PCR que utiliza sondas específicas.

Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el iniciador directo (forward) y el inverso (reverse). Cuando la sonda esta intacta, presentan una transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha fluorescencia no se produce cuando la sonda esta dañada y los dos fluorocromos están distantes, producto de la actividad 5`�3`exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio de patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.

Random Primer PCR

Esta variante de la técnica es muy sensible y especifica, es muy útil en el estudio y diagnóstico de organismos de una misma especie con variaciones genéticas especificas. Su aplicación permite la amplificación de moléculas de ADN y genomas que varían entre 400 pares de bases hasta 40 Mega bases. La técnica utiliza primes que consisten en un pool de de secuencias de los extremos 3’ del ADN y una región 5’ constante para la detección del primer incorporado 10 .

Aplicaciones

El diagnóstico molecular está revolucionando la práctica clínica de enfermedades infecciosas. Sus efectos serán importantes en la configuración de la atención de casos agudos donde oportunas y precisas herramientas de diagnóstico son esenciales para las decisiones de tratamiento del paciente y los resultados. PCR es la técnica molecular más desarrollada hasta ahora y tiene una amplia gama de aplicaciones clínicas, incluyendo la detección de patógenos específicos o de amplio espectro, evaluación de las infecciones emergentes, la vigilancia, la detección temprana de agentes biológicos y la creación de perfiles de resistencia a los antimicrobianos. Los métodos basados en PCR también pueden asociarse a los procedimientos tradicionales de diagnóstico. Otro avance de la tecnología es necesario para mejorar la automatización, optimizar la sensibilidad y especificidad y expandir la capacidad para detectar varios organismos simultáneamente. 11

La PCR convencional es utilizada como base para un gran número de técnicas en el laboratorio debido a su especificidad y rapidez.

Permite identificar especies de bacterias que producen determinados cuadros infecciosos. Esto se consigue, amplificando cierta zona del genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea características particulares que permitan identificar de una manera inequívoca la bacteria o agente causal.

En el caso de infecciones virales, que implican la integración del genoma del patógeno en el ADN del hospedador, como es el caso de la infección por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la determinación de la carga viral existente y por tanto, del estadio de la enfermedad 12, 13

De igual manera, la PCR es usada en servicios de donantes de sangre para test de rutina. Mediante la implementación de la PCR, se pueden detectar infecciones peligrosas en el donante (HIV, Hepatitis B) mientras aún están en el período de incubación.

A su vez, en el diagnostico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma, en las cuales los procedimientos se presentan largos y engorrosos, la PCR ha venido a facilitar este problema, amplificando mediante iniciadores correspondientes los diferentes genes para la identificación de mutaciones existentes14 .

En dermatología, la aplicación de la PCR en las enfermedades de la piel ha permitido conocer los mecanismos íntimos de muchas entidades, facilitando su diagnóstico e incluso su tratamiento. Esta técnica es ampliamente utilizada en el diagnóstico de enfermedades de la piel producida por parásitos, virus y bacterias; tales como leishmaniasis 15, lepra 16, oncocercosis 17 y virus de papiloma 18 , entre otras, ampliamente reportadas en la literatura.

En la fig 5 se muestra un ejemplo de una reacción de polimerasa utilizada para el diagnóstico de leishmaniasis cutánea producida por

Leishmania braziliensis.

La reacción se lleva a cabo un par de oligonucleotidos obtenidos a partir de una secuencia repetida de ADN nuclear de Leishmania braziliensis. Los oligos amplifican un fragmento de 603 pares de bases en L. braziliensis (banda mostrada en la figura). La reacción se realizó utilizando como molde ADN total extraído a partir de biopsias de pacientes con leishmaniasis cutánea localizada y es evidente la sensibilidad y especificidad en el diagnóstico.

123 45678910 M

603 pb

Fig 5.-Visualización del producto de PCR en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. La presencia del producto esperado (banda fluorescente) indica la positividad de la muestra para el organismo responsable de la patología observada. La muestra M, corresponde al marcador ADN utilizado como referencia. (Tomado de Rodríguez y col; 2005)

Las enfermedades hereditarias de la piel se caracterizan por mutaciones genéticas. El diagnóstico molecular por PCR está hoy en día disponible para múltiples enfermedades en las que anteriormente no se disponía de técnicas diagnósticas de laboratorio sino solamente la clínica.

El diagnóstico mediante PCR de las enfermedades hereditarias ofrece dos ventajas claras: en primer lugar, es notablemente sensible y con frecuencia es suficiente disponer de una sola célula nucleada, y en segundo lugar, todas las células del organismo contienen el mismo ADN lo que conlleva un riesgo elevado de tumores malignos 19. En otras enfermedades hereditarias existe una producción proteica defectuosa, frecuentemente en la zona de la membrana basal, como sucede en la Epidermólisis ampollosa distrófica y juntural que se manifiesta clínicamente como fragilidad cutánea y formación de ampollas sub-epidérmicas originadas por un trauma mínimo 20

En cuanto a las variantes de la PCR, estas técnicas han sido implementadas para el diagnóstico de numerosas enfermedades de la piel. Por ejemplo, la RT-PCR, puede ser aplicada para detectar translocaciones en los tumores de piel y partes blandas, como en el Liposarcoma mixoide y en sus variantes pobremente diferenciadas.

Una lista larga de cambios cromosómicos de tumores en dermatología se ha podido determinar con la implementación de la RT-PCR 21, 22

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En cuanto a las enfermedades congénitas o degenerativas de la piel se han descrito numerosas alteraciones cromosómicas que pueden igualmente ser detectadas por esta variante de la PCR. 19, 23

De igual manera, las variantes PCR asimétrica, PCR anclada y PCR anidada sirven para aumentar la sensibilidad y especificidad de la reacción y se utilizan cuando partimos de cantidades muy bajas de ADN problema. Se han diseñado protocolos de consenso específicos para la detección de un amplio espectro de Virus de papiloma humano (VPH) cutáneos no genitales o asociados a epidermodisplasia verruciforme 24. Por ejemplo en tejidos incluidos en parafina, el estudio de productos de PCR anidada obtenidos con iniciadores que codifican una proteína de 65 Kda común a todas las micobacterias, se ha observado que en un 80% de las lesiones cutáneas de sarcoidosis, una enfermedad granulomatosa sistémica, se ha podido identificar ADN de micobacterias. Mediante el análisis del patrón de enzima de restricción en estos productos de PCR (PCR/REPA) se han sub-clasificado las micobacterias detectadas en estos tejidos y han sido M. tuberculosis complex, M. aviumintracellulare y M. kansasii 25. Con la variante “anidada” de PCRelectroforesis en gel con gradiente de desnaturalización se detecta hasta un 90% de clonalidad en el receptor TCR-gamma en lesiones de micosis fungoides en todos los estudios 26 .

A su vez, el PCR multiplex, ha sido de gran utilidad en la detección del gen de la distrofina en la distrofia muscular de Duchenne 27 . De igual manera, empleando esta técnica y sondas flurogénicas se puede diagnosticar la enfermedad en varios tipos de muestra 28. En lo que respecta a la variante PCR “In situ”, esta se realiza sobre cortes de tejidos o extensiones citológicas, y posteriormente se detectan los productos amplificados en el lugar donde se encuentra el ADN. Con esta técnica, se ha podido detectar una única copia del genoma del VPH en una célula determinada 6 .

En otros estudios utilizando PCR se han podido determinar los genes involucrados en la atriquia universal congénita o atriquia con lesiones papulosas (una forma hereditaria de alopecia, en el que la pérdida de pelo ocurre poco después del nacimiento y años después se sigue una erupción papulosa difusa). Igualmente en la porfiria cutánea tardía esporádica se ha estudiado la mutación de un gen similar a MHC clase I cuya mutación se piensa que es la causa de la hemocromatosis.

En la dermatitis atópica, el estudio mediante PCR-RFLP en sangre periférica muestra un predominio significativo (85%) de homocigotos para alelos acetiladores lentos (N-acetiltransferasa 2, NAT2) entre los pacientes con dermatitis atópica, frente a un 54% en sujetos sanos29. Otros estudios describen una mayor frecuencia de acetiladores rápidos en pacientes con dermatitis alérgica de contacto que en controles 30

En familias japonesas se ha observado que las diferencias en la actividad transcripcional del gen de IL4 influyen en la predisposición a dermatitis atópica, al estudiar el polimorfismo del gen IL4. En otros estudios, usando marcadores muy polimórficos, se observa vínculos entre la dermatitis atópica y marcadores del cromosoma 11q13 (como D11S903 y el gen del receptor IgE de gran afinidad (FCER 1 B ó Fc (epsilon) RI-b Leu 181) 31, 32 con enfermedad respiratoria y una IgE sérica superior a 2000 IU/mL33 .

Mediante PCR con iniciadores específicos para segmentos V-gamma 1-8 y V-gamma 9 del gen del receptor de linfocitos T (TCRgamma), en combinación con electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes (PCR-DGGE), se ha observado que un 66% de micosis fungoides en estadio de placa y un 100% de micosis fungoides en estadio de tumor o de linfomas cutáneos de células T pleomórficos presentan reordenamientos clonales del gen TCR-gamma, mientras ninguno de los pseudos-linfomas cutáneos de células T, estudiados presentaban este reordenamiento.

La PCR se ha utilizado también para detectar mutaciones en toda la región de codificación del gen p53. Las mutaciones de p53, estudiadas con PCR-SSCP se encuentran con mayor frecuencia en carcinomas epidermoides infiltrantes que en el carcinoma in situ (enfermedad de Bowen) o micro-infiltrante. También se asocian a linfomas cutáneos primarios y a la evolución de micosis fungoides desde el estadio de placa al estadio tumoral 34 ya la transformación histológica del linfoma folicular en un linfoma difuso más agresivo 35. También se utiliza en el estudio de gen supresor tumoral, cuyas mutaciones se describen en el epitelioma basocelular y parecen ser más frecuentes en el epitelioma basocelular esporádico (30%) que en el asociado a xeroderma pigmentosa (11%). Además, se ha comprobado la coexistencia de mutaciones en p53 y en en el gen supresor tumoral en un 50% de los epiteliomas basocelulares asociados a xeroderma pigmentoso 36

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Consideraciones generales

La aplicación de las técnicas moleculares en las enfermedades de la piel sin duda alguna, ha generado un gran conocimiento sobre los mecanismos genéticos de muchas enfermedades y de muchas agentes etiológicos, facilitando su diagnóstico e incluso su tratamiento.

La PCR y sus variantes, en combinación con otras técnicas moleculares, ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad de pruebas moleculares para la identificación y cuantificación de los agentes infecciosos de interés clínico. Debido a sus indudables ventajas, como la facilidad de empleo, la mayor rapidez o el menor riesgo de contaminación, aunado a la alta especificidad y sensibilidad, están siendo aplicadas a una gran cantidad de patologías dermatológicas.

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