Diagnóstico Molecular de Enfermedades Infecciosas: Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Method

El control de enfermedades infecciosas, como por ej. leishmaniasis (Leishmania spp.), la enfermedad de Chagas (Trypanosoma cruzi) y la tripanosomiasis africana (T. gambiense), depende de un diagnóstico preciso y el tratamiento apropiado de los pacientes que la sufren. En muchos casos, la variabilidad genética intrínseca del agente infeccioso obliga al establecimieto de pruebas diagnósticas específicas para distinguir tal variabilidad;

es el caso de la diversidad de especies de Leishmania circulantes en un área determinada ^[1], o la tripanosomiasis africana producida por T. gambiense o T. rhodesiense ^[2]. Los métodos de diagnóstico de rutina estan basadas en la visualización del organismo infeccioso, o en aspectos fenotipicos tales como la evaluación de múltiples isoenzimas o reacciones inmunológicas entre otras.  En muchos casos estos métodos tienen sensibilidad limitada.

La amplificación de DNA o RNA mediante la técnica de la reacción en cadena de la DNA polimerasa (PCR, siglas en ingles) y sus variantes, además de los distintos enfoques para la detección de los productos que se generan, constituye una de las metodologías más valiosas en el campo de la medicina clínica. Se han desarrollado y aplicado una gran cantidad de ensayos de PCR con alta especificidad y sensibilidad en la identificación de organismos patógenos y el diagnóstico de enfermedades infecciosas (http://www.pcr-encyclopedia.com/pcr-diagnostics-6262.html). Los límites de detección de estos ensayos pueden alcanzar por ej. <10 copias de la secuencia blanco y en algunos casos, cuando se utliza DNA purificado, puede detectarse del orden de fentogramos (fg=10^-15 g), cantidad que en general es menor a la contenida en un organismo infeccioso (picogramos, pg=10^-12 g). Entre las principales limitaciones de esta metodología está el costo del instrumental (termociclador), lo elaborado de los métodos de detección y lo impráctico de su implementación en condiciones de campo.

Recientemente, se desarrollo una nueva variante de la técnica de PCR llamada Amplificación Isotérmica Mediada por Lazo (LAMP: Loop-Mediated Isothermal Amplification Method) ^[3]. Esta metodología utiliza múltiples iniciadores (“primers”) y condiciones isotérmicas (60-65 °C) para la amplificación de la secuencia blanco, en un tiempo relativamente corto (30 min-1h), utilizando la Bst-DNA polimerasa (Bst-DNApol). LAMP no requiere termociclador para garantizar los ciclos de denaturalización-reasociación para la hibridación de los primers y la actividad de la polimerasa, como ocurre en la PCR. Similar a una reacción de PCR anidada (“nested PCR”), LAMP requiere de varios primers, 4 a 6, que reconocen y se unen por homología a distintas regiones del blanco; estos primers pueden generarse a través del software Primer Explorer v3 (https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html). La síntesis de DNA es producto de la actividad de polimerización y desplazamiento de cadena de DNA (5´ ® 3´) por parte de la polimerasa, debido al anclaje permanente de los primers sobre los productos de amplificación que se generan. La reacción genera en corto tiempo una cantidad extraordinaria del producto de amplificación, el cual esta representado por una estructura de múltiples lazos con tallos sobre el DNA blanco, dando un aspecto parecido a las flores de un coliflor. El proceso es altamente específico y de una sensibilidad comparable al mejor ensayo de PCR. La observación del producto de amplificación puede hacerse visualmente por turbidez o por cambio de color asociado a reactivos propios de la reacción ^[4].

Dada la simplicidad de LAMP, se han desarrollado distintos ensayos de alta especificidad, sensibilidad y facilidad de uso en condiciones de campo para el diagnóstico molecular de varios agentes infecciosos, tales como Plasmodium spp.^[5] y Trypanosoma spp.^[6].

Referencias

1. L. I. C. Coelho et al. (2010) Characterization of Leishmania spp. causing cutaneous leishmaniasis in Manaus, Amazonas, Brazil. PARASITOLOGY RESEARCH DOI: 10.1007/s00436-010-2139-9 http://www.springerlink.com/content/r7175760417q6177/
2. Z.K. Njiru et al. (2007). African trypanosomiasis: Sensitive and rapid detection of the sub-genus Trypanozoon by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of parasite DNA Int. J. Parasitol. doi:10.1016/j.ijpara.2007.09.006 http://www.finddiagnostics.org/export/sites/default/programs/hat/docs/Njiru_african_tryps.pdf
3. Notomi T. et al. (2000). Loop-mediated isothermal amplification of DNA. NAR 28 (12) e63. http://nar.oxfordjournals.org/content/28/12/e63.full.pdf+html
4. Wastling SL, et al. (2010). LAMP for Human African Trypanosomiasis: A Comparative Study of Detection Formats. PLoS Negl Trop Dis 4(11): e865. doi:10.1371/journal.pntd.0000865

http://www.plosntds.org/article/info:doi/10.1371/journal.pntd.0000865;jsessionid=DFA466F0851054A3520BCA83CDB5B1ED.ambra02

5.     Hiroshi Iseki et al. (2010). Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Method as a Tool for Diagnosis of Infection by the Zoonotic Simian Malaria Parasite Plasmodium knowlesi. J Clin Microbiol. 48:2509-2514.

http://jcm.asm.org/cgi/content/abstract/48/7/2509

6.     Njiru ZK, et al. (2008) Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Method for Rapid Detection of Trypanosoma brucei rhodesiense. PLoS Negl Trop Dis 2(2): e147. doi:10.1371/journal.pntd.0000147 http://www.plosntds.org/article/info:doi/10.1371/journal.pntd.0000147